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荧光原位杂交技术(Fish)检测

 

  是一种重要的非放射性原位杂交技术,出现于20世纪70年代末的遗传学实验技术。它根据碱基互补配对原则,通过特殊手段使带有荧光物质的探针与目标DNA接合,最后用荧光显微镜即可直接观察目标DNA所在的位置。

技术原理

  荧光原位杂交技术的基本原理是如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的,二者经变性—退火—复性,即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛,可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应,经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

技术要点

  1. FISH选用的标本可以是分裂期细胞染色体,也可以是间期细胞。
  2. 生物素、地高辛、Dinitrophenyl (DNP)、Ami-noacetyl Fluorine(AAF)等均可用于探针标记。近年来,大片段的DNA探针(100-400 kb)已被研制出来,由于控针较长,故可将荧光物质直接标记在核苷酸上,使杂交过程进一步简化,而且杂交信号更强 
  3. 荧光原位杂交可以通过CCD(电荷耦合器件)相机系统或激光共聚焦扫描成像系统将摄取的信号存储在计算机中,经过软件特殊处理后显示在屏幕上。使用数码成像相机系统或CCD相机系统,灰度图像被拍摄几次并存储在计算机中,接下来通过一些人造色,软件系统接收获得的示例图像,经过软件的综合处理,最后以多色图像显示出来。此外,在G-带状染色体被75酒精或甲醇褪色后,FISH可以更清楚地识别易位。

实验流程

  1. 样本采集
  2. 固定
  3. 制备载片
  4. 细菌预处理
  5. 第一次杂交
  6. 第一次洗脱
  7. 封片
  8. 检测结果:可使用荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜进行观察,结合相关软件,进行数据整理及分析。

 

 

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