稳定表达细胞系构建

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详细介绍

  将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上,载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中,用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素(neomycin)潮霉素(hygromycin)嘌呤霉素(puromycin),筛选得到可稳定表达目的蛋白,或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。

 

  慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达,因此,慢病毒常用于制备稳定表达/沉默特定基因的单克隆细胞株。

 

稳转株主要应用于以下研究中:

  1、需要长期在目的细胞中研究基因功能。通过构建稳定株,可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本,也方便长期的实验研究

  2、部分蛋白半衰期及长,瞬时RNA只能干扰表达,无法去除已经表达的目的蛋白,通过构建稳定株可以实验更好的基因干扰效果

  3、瞬转会引入不可预期的拷贝数表达(往往瞬时表达较高),导致因为人为因素造成实验结果的不精确,构建稳定株可以帮助筛选到拷贝数适量的细胞进行实验研究

  4、稳转株可以用于诱导表达系统的实验,用于控制基因的时空表达

  5、需要用目的细胞构建动物模型的实验,往往需要构建成稳定株

 

注意事项(有多种因素容易导致稳转株构建失败)

  1、支原体污染问题

  2、慢病毒保存不当

  3、慢病毒制备后反复冻融

  4、目的基因表达水平低

  5、细胞感染病毒后毒性大导致细胞死亡

 

技术流程

  1、目的细胞的合适抗生素浓度筛选

  2、目的细胞的合适病毒滴度筛选

  3、慢病毒构建与包装与滴度测定

  4、慢病毒感染

  5、特定抗生素筛选稳转细胞株

  6、稳转细胞株鉴定

 

服务说明

  1、T25一瓶和冻存株一支

  2、照片、实验步骤及检测结果

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