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qPCR 引物篇:普通PCR 和 qPCR 引物 是否一样?

 

Q问题: 普通PCR 和 QPCR 引物 是否一样?

A 回答: 二者的设计原则有相同也有不同;

 

相同处
• 序列的查找是一致的;
• 序列选取应在基因的保守区段;
• 选取合适的扩增片段大小
• 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对;
• 避免引物自身形成环状发卡结构;
• Tm值在55-65℃,GC含量在40%-60%;
• 引物之间的TM相差避免超过2℃;
• 引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基;

不同处:
Real time PCR 引物
• PCR 产物长度;real-time PCR要求在300bp以内,一般首选80-150bp 之间;
• 多对目的基因同时扩增,文献上查来的引物条件会不同,需要设计尽可能条件一致的引物;
• 目的基因含量比较低时,需要设计灵敏度比较高的引物;
• 相对电泳法,Real time PCR灵敏度比较高,对引物的要求更高,引物二聚体要少;熔解曲线要求单一产物;
• Real time PCR的目的是进行定量或者相对定量,对扩增的效率有要求;对引物的二级结构要求高;

普通PCR 引物:
• 根据实验的要求不同,长度一般是从150bp到几千bp 不等;
• 对二级结构要求没有real time PCR 高;
• 对扩增效率要求不高;
• 可以选用梯度PCR 仪,选择不同退火温度,对引物退火温度要求不需要一致;

验证时不同:

引物的特异性(相同点):

引物的特异性在使用前用blast 来保证;

不同点:real time PCR
在实验结果中通过熔解曲线来验证;
PCR的特异性产物峰应与引物报告中的PCR product 相差在两度之内;

普通PCR 通过产物的长度,跑条带,来鉴别产物的特异性;

Real time PCR 可以通过扩增曲线,熔解曲线分析来鉴别产物的相对量,同时也可以对终产物进行电泳分析,更全面,更科学!

 

 

 

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