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腺病毒包装

  • 分类:无分类内容
  • 发布时间:2019-10-16 00:00:00
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  腺病毒包装

  腺病毒是直径约80-120 nm的无包膜的线性双链DNA病毒,可迅速感染分裂和非分裂期细胞,与细胞表面受体结合后通过内吞作用进入细胞,在细胞核孔附近聚集,并在感染后2h将腺病毒的DNA释放到细胞核中并开始蛋白表达。腺病毒载体来源于诱发普通感冒的腺病毒,野生型腺病毒基因组是线性双链DNA。

  腺病毒重组载体构建完成后转染进入包装细胞。在包装过程中,位于两个反向重复序列(ITRs)之间的DNA片段与由包装细胞表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。

  当病毒转导宿主细胞时,两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞,并以游离DNA的形式存在于细胞核中。

  通过改造优化,我们的腺病毒载体缺失了E1A、E1B和E3区,前两者与病毒包装相关(这两个基因已被整合到包装细胞的基因组中)。因此,运用我们的病毒载体包装出来的病毒是复制缺陷型的(只能转导靶细胞而不能自我复制),大大提高了生物安全性。

  腺病毒包装的特点

  1.可感染的细胞种类多,宿主广泛;

  2.感染效率高,特别适合质粒载体转染效率低的细胞,如原代细胞、神经细胞等,且目的蛋白表达水平高;

  3.可包装大片段的外源基因,高达10kb;

  4.不整合到细胞染色体中,生物安全性高。

  腺病毒包装技术主要原理是将目的片段克隆到腺病毒表达载体上,表达载体和包装质粒通过重组导入腺病毒包装细胞进行包装,包装好的病毒进一步进行扩增和滴度测定。

  注意事项

  1.细胞生长状态对于病毒包装至关重要,因此需要保证良好的细胞生长状态和较少的细胞传代次数,细胞代数不要超过20代。

  2.在质粒转染时细胞培养基里面不要添加抗生素(如P/S、G418等)。

  3.病毒切勿反复冻融,冻融次数尽量不要超过3次,每冻融一次大约有10%左右的病毒损失,应按每次使用的病毒量来分装然后冻存于-80℃冻箱,保存时间尽量不要超过6个月。

  技术流程

  1.获得目的基因序列;

  2.构建病毒表达载体质粒;

  3.表达载体质粒和包装质粒重组;

  4.感染293A细胞,包装出病毒;

  5.病毒扩增、浓缩;

  6.滴度测定。

  服务说明

  1.客户提供目的基因的序列,如果提供模板,请告知载体、酶切位点等信息;

  2.序列过长可能影响病毒滴度;

  3.目的蛋白的功能验证另外收费。

  提交的产品和资料:

  1.实验报告;

  2.提供至少1ml滴度≥10010PFU/ml的病毒,特殊基因除外。

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